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溶组织内阿米巴荧光定量 PCR 检测试剂盒(染料法)
人阅读 发布时间：2023-11-17 09:18
产品及特点
阿米巴原虫由于生活环境不同可分为内阿米巴和自由阿米巴，前者寄生于人和动 物，后者生活在水和泥土中，偶尔侵入动物机体。对人类危害最大的是属于内阿米巴属
的溶组织内阿米巴（Entamoeba histolytica），它会引发阿米巴痢疾和肝脓肿，引发 的病例多，感染面广，危害大。因此对溶组织内阿米巴进行快速灵敏的诊断具有重要的 意义。本产品就是根据溶组织内阿米巴 rRNA 编码基因的保守区设计引物而开发的高灵
敏荧光定量 PCR 产品。本试剂盒具有下列特点：
1. 根据溶组织内阿米巴 rRNA 编码基因保守序列设计的专一性引物，与其他肠道疾病
病原体（如 B.hominis、E.coli、E.dispar、E.moshkovskii、V.cholerae 等）
无交叉反应。
2. 灵敏度比常规 PCR 高 2-3 个数量级，可以达到几十拷贝/反应。
3. 即开即用，用户只需要提供样品模板，操作简单，定量准确快速。
4. 一管式荧光定量 PCR 检测，避免后续污染。
5. 本试剂盒足够 100 次 20uL 反应体系的荧光定量 PCR。
6. 本产品只适用于科研，不能用于临床诊断。
规格及成分
成分
编号
十孔盒包装（去纸托）
2×qPCR MagicMix
90408
0.5 mL（装 A 袋）
超纯水
100935
1 mL（装 A 袋）
溶组织内阿米巴 PCR 引物 F
14-82110f
0.5 OD（装 B 袋）
溶组织内阿米巴 PCR 引物 R
14-82110r
0.5 OD（装 B 袋）
溶组织内阿米巴基因阳性对照
(1×10E8 copy/μL)
14-82110pc
50 μL（装 C 袋）
使用手册
11-3390sc
1 份
运输及保存 低温运输、-20℃保存(A 袋试剂放样品准备区、C 袋的阳性对照最好分开放置)，有效期
一年。
自备试剂 DNA 模板、10×ROX（根据机型决定，具体见使用方法）。
使用方法 一、样品 DNA 的制备
1. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数原虫 DNA 提取试剂盒兼
容。本公司的柱式粪便 DNA 提取试剂盒也可以用于溶组织内阿米巴 DNA 提取。
二、引物的制备（在样品制备室进行）
2. 按引物标签提示在装引物干粉的管中直接加入适量的超纯水（加入量见引物试管上
的标签），使得两条引物的浓度均为 10μM（10pmol/μL），然后各取 110μL 混
合在一起得 220μL，标注为引物混合物，放冰上待用。220μL 足够 100 次 qPCR反应。
三、稀释阳性对照（以 10E2-10E7 这 6 个 10 倍稀释度为例。由于标准品浓度非常高，
因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成
分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，
只提供可以直接使用的长为 134 bp 的 DNA 片段作为阳性对照。
3. 标记 6 个离心管，分别为 7，6，5，4，3，2。
4. 用带芯枪头分别加入 45 μL 超纯水（最好用带芯枪头，下同）。
5. 在 7 号管中加入 5 μL 1×10E8 拷贝/μL 的阳性对照，充分震荡 1 分钟，得
1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头，在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，
充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
7. 换枪头，从 6 号管中取 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照到 5 号管中，充分震
荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
8. 换枪头，从 5 号管中取 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照到 4 号管中，得
1×10E4 拷贝/μL 的阳性对照。放冰上待用。
9. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
三、设置 qPCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
10. 在 PCR 管中加入下列成分（待测样品需要做三次重复，下表只列出一次。样品管
和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子
储存好后最后加）：
成分
样品
阴性对照 阳性对照（2-7 管）
2×qPCR MagicMix
10 μL
10 μL
各 10 μL
引物混合物
2 μL
2 μL
各 2 μL
自备 10×ROX (见注)
2 μL
2 μL
各 2 μL
待测样品 DNA 模板
1-5 μL
不加
不加
阳性对照（2-7 号）
不加
不加
各 5μL（2 号样到
2 号管，3 号样到 3
号管…）
补水到
20 μL
20 μL
20 μL
注:仅 ABI7500、7700 和 7900 仪器需要使用 ROX 作为对照，其他荧光 PCR 仪
器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene
3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX。
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 PCR（具体 PCR 参数可以根据仪器不同而自行优化）。
过程
温度
时间
预变性
95℃
3 分钟
PCR 反应
（45 个循环）
95℃
30 秒
55℃
30 秒
72℃
30 秒
12. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。一般在复性步骤采集荧光数据。本产品中所
含的荧光染料在不结合 DNA 时，最大吸收光谱在 471 nm，结合 DNA 时的最大
吸收光谱在 500 nm，最大发射光谱在 530 nm。
四、数据处理
13. 以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品
的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
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