细胞色素 b5

细胞色素 b5（Cytochrome b5）含量测定试剂盒说明书
 微量法 100T/96S
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：
细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其
是药物和毒物的代谢。细胞色素 P450 和细胞色素 b5 是 P450 酶系的两个血红素蛋白，其比
值的变化与 P450 代谢活性密切相关。
测定原理：
氧化型细胞色素 b5 经连，二亚硫酸NA还原后，在 424nm 处有最大吸收峰，通过测定 424nm 和
490nm 处吸光值的差异，即可计算出细胞色素 b5 的含量。
自备仪器和用品：
普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔
板、和蒸馏水。
试剂组成和配制：
试剂一：粉剂×2 瓶，4℃保存。临用前各加 100mL 蒸馏水，充分溶解。
试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。
工作液配制：临用前配制，戴一次性手套，小心打开试剂三瓶盖，加试剂二 20mL 充分溶解，
4℃避光可保存 1 周。
样品中细胞色素 b5 提取：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，
10 000g 4℃离心 30min，取上清液，转入超速离心管中。
2、粗制微粒体：100 000g，4℃离心 60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g
离心 30min，弃上清液。
4、待测液：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即待测液，该待测
液需当天测定。
细胞色素 b5 含量测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min。
2. 工作液置于 25℃水浴中预热 30 min。
3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 10 μL 蒸馏水，200μL 工作液，室温静置 2 min，424nm
和 490nm 处吸光值，424nm 处吸光值记为 A 空白管 1，490nm 处吸光值记为 A 空白管 2。
△ A 空白管= A 空白管 1- A 空白管 2
4. 测定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 10 μL 待测液，200μL 工作液，室温静置 2 min，424nm
和 490nm 处吸光值，424nm 处吸光值记为 A 测定管 1，490nm 处吸光值记为 A 测定管 2。
△ A 测定管= A 测定管 1- A 测定管 2。
注意：只需要做一个空白管。
样品细胞色素 b5 含量计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
细胞色素 b5 含量(nmol/mg prot) = (△ A 测定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷（Cpr×V 样）
= 0.1228×(△ A 测定管-△ A 空白管)÷Cpr

（2）按样本质量计算
细胞色素 b5 含量（nmol/g）= (△ A 测定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反总×（V 样总÷V 样）÷W
 = 0.0614×(△ A 测定管-△ A 空白管)÷W
ε：还原型细胞色素 b5 纳摩尔消光系数，171×10-3
L/nmol/cm；d：比色皿光径（cm），1cm；
V 反总：反应体系总体积，210 μL =2.1×10-4
L；Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要另
外测定；V 样：加入反应体系中待测液体积，10 μL=0.01 mL；V 样总：待测液总体积，0.5 mL；
W：样品质量（g）。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
（1）按蛋白浓度计算
细胞色素 b5 含量(nmol/mg prot) = (△ A 测定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷（Cpr×V 样）
 = 0.2456×(△ A 测定管-△ A 空白管)÷Cpr
（2）按样本质量计算
细胞色素 b5 含量（nmol/g）= (△ A 测定管-△ A 空白管)÷(ε×d)×V 反总×（V 样总÷V 样）÷W
 = 0.1228×(△ A 测定管-△ A 空白管)÷W
ε：还原型细胞色素 b5 纳摩尔消光系数，171×10-3
L/nmol/cm；d：96 孔板光径（cm），0.5cm；
V 反总：反应体系总体积，210 μL =2.1×10-4
L；Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要
另外测定；V 样：加入反应体系中待测液体积，10 μL=0.01 mL；V 样总：待测液总体积，
0.5 mL；W：样品质量（g）。