产品及特点AFLP（amplified fragment length polymorphism）原理是一种结合RFLP 和PCR 技术特点的、迄今为止最有效分子标记分型技术，其原理如下：             本产品在传统 AFLP-PCR 的基础上经过精心优化而开发，它具有下列特点：1. 一站式，足够50 次酶切-连接反应、50 次预扩反应和1500 次AFLP PCR（30 uL体系计算），但不包括DNA 纯化和带型分析试剂（如PAGE 电泳试剂和银染试剂）。2. 本系列产品提供EcoRI-MseI 组合，适用于GC 含量在50%以上的基因组。对GC 含量在50%以下的基因组，需从本公司采购AFLP 的EcoRI-TaqI 组合。3. 各种参数都经过优化，一次PCR 所得AFLP 片段数一般在10-100 之间，可重复性好，误差小于0.6%。4. 本产品适用于基因组在500 Mb-6000 Mb 的材料（如动物和植物）。对于基因组在50-500 Mb 的材料（如细菌和真菌）或50Mb 以下的材料（如质粒，cosmid，BAC，YAC 和PAC 等），需要分别另购+0 型预扩增引物对和+2 型扩增引物。规格及成分 成 份编 号小扁盒包装 AFLP 酶切-连接 Buffer，10×100903a100 uL（绿盖）AFLP EcoRI-MseI 酶混合液100903b50 uL（红盖）AFLP EcoRI-MseI 接头混合物100903c1000 uL（黄盖）T4 DNA 连接酶12041150 uL（蓝盖）PCR MagicMix 3.0908055 mL×6+1 型 EcoRI-MseI 预扩增引物对100903d100 uL（白盖）+3 型 EcoRI 引物（8 条）100903e各 1OD（本色压盖）+3 型 MseI 引物（8 条）100903f各 1OD（本色压盖）使用手册100903sc1 份+3 型 EcoRI 引物和+3 型 MseI 引物最后碱基的序列


  引物名称8 条引物 3’最后碱基 +3 型 EcoRI 引物-AAC、-AAG、-ACA、-ACT、-ACC、-ACG、-AGC、-AGG+3 型 MseI 引 物-CAA、-CAC、-CAG、-CAT、-CTA、-CTC、-CTG、-CTT运输及保存低温运输、-20℃保存, 有效期一年。自备试剂超纯水、Southern级 DNA 纯化试剂，尿素-PAGE电泳套装，银染试剂盒。使用方法一、 DNA 提取（本试剂盒不提供相关试剂）用户需要自备50-500ng Southern 级别的基因组DNA，DNA 酶切彻底是AFLP 的关键，所以最好预实验以确保DNA 能够被EcoRI 和MseI 内切酶彻底切开。二、 限制性酶切和接头连接反应（本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的酶切-连接反应）1. 在0.2 mL 离心管中设置20 uL 的限制性内切酶酶切体系：成分	用量AFLP 酶切-连接 Buffer，10×	2 uL样品 DNA		50 ng（对小基因组材料） 500 ng（对大基因组材料）AFLP EcoR I-Mse I 酶混合液	1 uL自备超纯水	加水到 20 uL2. 轻柔混匀并短暂离心后，37℃保温2 小时酶切（若PCR 仪器不带热盖，则必须加50uL自备石蜡油，否则水分会蒸发影响反应。下同）。反应结束后70℃保温15 分钟灭活酶。3. 在体系中加入20 uL EcoRI-MseI 接头混合物和1 uL T4 DNA 连接酶，轻柔混匀并短暂离心，20℃保温2-3 小时让接头跟酶切DNA 片段相连。4. 反应结束后在40uL 的连接反应体系中加入360uL 超纯水，得到连接液10 倍稀释液，直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用。三、 预扩增（本试剂盒足够 40 次 30uL 体系的预扩增反应）5. 在0.2 mL 离心管中设置30 uL 的预扩PCR 体系：成分	体积连接液 10 倍稀释液（来于第 4 步）	5 uL+1 型 EcoRI-MseI 预扩增引物对	10 uLPCR MagicMix 3.0	15 uL6. 离心数秒，按下列参数进行 PCR 预扩增（注意：第一步是预合成，跟常规PCR 不同）：       7. 取10 uL PCR 产物在1.5%琼脂糖胶上电泳检测，产物应为大小在100-1500 bp 的模糊


 条带。本试剂盒的 PCR mix 含上样液和示踪染料，故不需要额外加 Loading Buffer。示踪染料的泳动速度相当于 50bp 的 DNA 片段。8. 在剩下的20uL 预扩增反应液中加入980uL 的超纯水，相当于稀释50 倍，所得50 倍PCR 稀释液，直接作为模板用于下步扩增或放-20℃保存待用。四、选择性PCR 扩增9. 制备引物：在16 管引物干粉中分别加入1100uL 超纯水，震荡混匀得引物母液。各取66uL引物母液与1034uL 超纯水在1.5mL 离心管中混合得1100uL 各引物工作液。10. 在0.2 mL PCR 管中，加入下列成分（第一次需要测试所有64 种引物组合。若已经知道哪个一种或几种引物组合适合，则可以直接使用选中的引物），下面以一种为例：成分	体积50 倍PCR 稀释液	5 uLAFLP+3 型 EcoR I 引物工作液（八种之一） 5 uLAFLP+3 型 Mse I 引物工作液（八种之一） 5 uLPCR MagicMix 3.0	15 uL11. 轻柔混匀后离心数秒，按下列参数进行PCR：          四、 尿素-PAGE 电泳和银染（需另购试剂并按相关手册进行）12. PCR 结束后进行尿素-PAGE 电泳和银染分析。关联产品AFLP 试剂盒（EcoRI-TaqI）