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AFLP 试剂盒(EcoRI-MseI) AFLP Kit(EcoRI-MseI)

发布时间:2019-08-13 10:10 |  点击次数:


产品及特点AFLP(amplified fragment length polymorphism)原理是一种结合RFLP 和PCR 技术特点的、迄今为止最有效分子标记分型技术,其原理如下:             本产品在传统 AFLP-PCR 的基础上经过精心优化而开发,它具有下列特点:1. 一站式,足够50 次酶切-连接反应、50 次预扩反应和1500 次AFLP PCR(30 uL体系计算),但不包括DNA 纯化和带型分析试剂(如PAGE 电泳试剂和银染试剂)。2. 本系列产品提供EcoRI-MseI 组合,适用于GC 含量在50%以上的基因组。对GC 含量在50%以下的基因组,需从本公司采购AFLP 的EcoRI-TaqI 组合。3. 各种参数都经过优化,一次PCR 所得AFLP 片段数一般在10-100 之间,可重复性好,误差小于0.6%。4. 本产品适用于基因组在500 Mb-6000 Mb 的材料(如动物和植物)。对于基因组在50-500 Mb 的材料(如细菌和真菌)或50Mb 以下的材料(如质粒,cosmid,BAC,YAC 和PAC 等),需要分别另购+0 型预扩增引物对和+2 型扩增引物。规格及成分 成 份编 号小扁盒包装 AFLP 酶切-连接 Buffer,10×100903a100 uL(绿盖)AFLP EcoRI-MseI 酶混合液100903b50 uL(红盖)AFLP EcoRI-MseI 接头混合物100903c1000 uL(黄盖)T4 DNA 连接酶12041150 uL(蓝盖)PCR MagicMix 3.0908055 mL×6+1 型 EcoRI-MseI 预扩增引物对100903d100 uL(白盖)+3 型 EcoRI 引物(8 条)100903e各 1OD(本色压盖)+3 型 MseI 引物(8 条)100903f各 1OD(本色压盖)使用手册100903sc1 份+3 型 EcoRI 引物和+3 型 MseI 引物最后碱基的序列


  引物名称8 条引物 3’最后碱基 +3 型 EcoRI 引物-AAC、-AAG、-ACA、-ACT、-ACC、-ACG、-AGC、-AGG+3 型 MseI 引 物-CAA、-CAC、-CAG、-CAT、-CTA、-CTC、-CTG、-CTT运输及保存低温运输、-20℃保存, 有效期一年。自备试剂超纯水、Southern级 DNA 纯化试剂,尿素-PAGE电泳套装,银染试剂盒。使用方法一、 DNA 提取(本试剂盒不提供相关试剂)用户需要自备50-500ng Southern 级别的基因组DNA,DNA 酶切彻底是AFLP 的关键,所以最好预实验以确保DNA 能够被EcoRI 和MseI 内切酶彻底切开。二、 限制性酶切和接头连接反应(本试剂盒足够 50 次 20uL 体系的酶切-连接反应)1. 在0.2 mL 离心管中设置20 uL 的限制性内切酶酶切体系:成分	用量AFLP 酶切-连接 Buffer,10×	2 uL样品 DNA		50 ng(对小基因组材料) 500 ng(对大基因组材料)AFLP EcoR I-Mse I 酶混合液	1 uL自备超纯水	加水到 20 uL2. 轻柔混匀并短暂离心后,37℃保温2 小时酶切(若PCR 仪器不带热盖,则必须加50uL自备石蜡油,否则水分会蒸发影响反应。下同)。反应结束后70℃保温15 分钟灭活酶。3. 在体系中加入20 uL EcoRI-MseI 接头混合物和1 uL T4 DNA 连接酶,轻柔混匀并短暂离心,20℃保温2-3 小时让接头跟酶切DNA 片段相连。4. 反应结束后在40uL 的连接反应体系中加入360uL 超纯水,得到连接液10 倍稀释液,直接作为模板用于下步的预扩增或放-20℃保存待用。三、 预扩增(本试剂盒足够 40 次 30uL 体系的预扩增反应)5. 在0.2 mL 离心管中设置30 uL 的预扩PCR 体系:成分	体积连接液 10 倍稀释液(来于第 4 步)	5 uL+1 型 EcoRI-MseI 预扩增引物对	10 uLPCR MagicMix 3.0	15 uL6. 离心数秒,按下列参数进行 PCR 预扩增(注意:第一步是预合成,跟常规PCR 不同):       7. 取10 uL PCR 产物在1.5%琼脂糖胶上电泳检测,产物应为大小在100-1500 bp 的模糊


 条带。本试剂盒的 PCR mix 含上样液和示踪染料,故不需要额外加 Loading Buffer。示踪染料的泳动速度相当于 50bp 的 DNA 片段。8. 在剩下的20uL 预扩增反应液中加入980uL 的超纯水,相当于稀释50 倍,所得50 倍PCR 稀释液,直接作为模板用于下步扩增或放-20℃保存待用。四、选择性PCR 扩增9. 制备引物:在16 管引物干粉中分别加入1100uL 超纯水,震荡混匀得引物母液。各取66uL引物母液与1034uL 超纯水在1.5mL 离心管中混合得1100uL 各引物工作液。10. 在0.2 mL PCR 管中,加入下列成分(第一次需要测试所有64 种引物组合。若已经知道哪个一种或几种引物组合适合,则可以直接使用选中的引物),下面以一种为例:成分	体积50 倍PCR 稀释液	5 uLAFLP+3 型 EcoR I 引物工作液(八种之一) 5 uLAFLP+3 型 Mse I 引物工作液(八种之一) 5 uLPCR MagicMix 3.0	15 uL11. 轻柔混匀后离心数秒,按下列参数进行PCR:          四、 尿素-PAGE 电泳和银染(需另购试剂并按相关手册进行)12. PCR 结束后进行尿素-PAGE 电泳和银染分析。关联产品AFLP 试剂盒(EcoRI-TaqI)