上海彩佑实业有限公司

https://caiyou.biomart.cn

公众号

扫一扫
进入手机商铺

商家诚信度:
成立时间:2012年
入驻丁香通年限:2年
商家等级:金牌客户
产品信息完整度:89%
公众号

微信扫一扫
关注公众号

公司新闻

猪螺杆菌探针法荧光定量PCR试剂盒

发布时间:2019-08-08 11:15 |  点击次数:

产品及特点
1. 即开即用,用户只需要提供猪螺杆菌样品。
2. 根据猪螺杆菌探针法荧光定量保守序列设计的专一性引物,与相关病毒无交叉反应。
3. 灵敏度可以达到几百拷贝/反应。
4. 一管式荧光定量PCR检测,避免后续污染。
5. 本试剂盒足够50次20μL反应体系的荧光定量PCR。
本产品只适用于科研,不能用于临床诊断。
规格及成分
成分    编号    十孔盒包装
2×qPCR MagicMix    试剂一    500μL(棕色管)
荧光PCR专用模板稀释液    试剂二    1 mL(黄盖)
猪螺杆菌探针法荧光定量PCR引物混合物    试剂三    100μL(白盖)
猪螺杆菌探针法荧光定量PCR阳性对照
(1×10E8 拷贝/μL)    试剂四    50μL(红盖)
使用手册    试剂五    1份
运输及保存
低温运输,-20℃保存,保存期限一年。
自备试剂 
DNA模板、10×ROX(根据机型决定,具体见使用方法)。
使用方法
一、稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)
1. 注意:由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中,充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
8. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4 拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5 拷贝/μL,10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品,则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。
三、设置qPCR反应(20 μL体系,在样品制备室进行)
10. 如果只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复,则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加):
成分    样品管
N+2个    PCR阴性对照管    PCR阳性
对照管(2-7管)
2×qPCR MagicMix
(棕色管)    10 μL    10 μL    各10 μL
猪螺杆菌探针法荧光定量PCR
引物混合液(白盖)    2 μL    2 μL    各2 μL
自备10×ROX (见注)    2 μL    2 μL    各2 μL
 N+2待测样品DNA模板    6 μL    不加    不加
第7步所得PCR阳性对照
稀释液(2-7号)    不加    不加    各6μL(2号样到2号管,3号样到3号管…)
注:仅ABI7500、7700和7900仪器需要使用ROX作为对照,其他荧光PCR仪器(如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480)不需要使用ROX,则用水替代。
12. 盖上盖子后上机,按下面参数进行PCR(具体PCR参数可以根据仪器不同而自行优化)。
过程    温度    时间
预变性    92℃    5分钟
PCR反应
(30个循环)    92℃    60 秒
54℃    60 秒
72℃    60 秒
13. 数据采集
具体操作按所用仪器推荐的流程进行。本产品中所含的荧光染料在不结合DNA时,大吸收光谱在471 nm,结合DNA时的大吸收光谱在500 nm,大发射光谱在530 nm。信号采集可以设置在复性或延伸步骤。 
四、数据处理
14. 如果把本试剂盒用于定量检测,则以阳性对照浓度的log值为横轴,以Ct值为纵轴,绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值,再推算出其浓度。
如果把本试剂盒用于定性检测,只判断阳性或阴性,则阴性对照Ct必须大于或等于40。阳性对照必须有荧光对数增长,有典型扩增曲线,Ct值应该小于或等于30。对待测样品,如果其Ct大于或等于40则为阴性,如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间,则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性,如果小于40,则为阳性。