酵母化学感受态细胞制备试剂盒

 

常温运输和保存

 

Yeast Chemical Competent Cell Preparation Kit

 

产品及特点 本酵母化学感受态细胞制备试剂是一种通过化学处理，高效快速制备酿酒酵   母化学感受态细胞，用于长期冻存以备后续转化的产品，它具有下列特点：

 

1.一次制备，-80℃保存，多次使用，免去每次转化都要制备酿酒酵母感受态细胞。

 

2.操作简单，单溶液制备，除酵母培养的时间外，整个操作只需要 30 分钟

 

主要用于酿酒酵母S. cerevisiae，也适用于其他多种实验用酵母菌株，包括S. pombe、C. albicans、Pichia pastoris 等。

 

3.受体酵母可以不含质粒，也可用于携带有选择性质粒的酵母（如双杂交体系   中的酵母）。

 

4.对酿酒酵母，高转化效率可达到 0.2-1×105 个转化子/ug 质粒 DNA。对其他酵母，效率稍低，范围在 100-2000 个转化子/ug 质粒 DNA。

 

5.得到的感受态细胞可以用各种线性或环状酵母穿梭质粒 DNA 进行转化，例如 YIp,  YRp,  YCp,  YEp 和 YAC 等 。

 

6.可以用于酵母双杂交、定点突变（Site－Directed Mutagenesis）、基因破坏（Gene Disruption）、等位突变基因修复（Mutant Allele Recovery）等实验。

 

7.本产品可以制备 20 只酵母感受态细胞（需要 200mL 酵母培养液），并还带

 

高效转化液。

 

规格及成分 成 份 编 号 小纸盒包装

 

制备液 A 81109A 120 mL

 

制备液 B 81109B 6 mL

 

制备液 C 81109C 10 mL

 

转化液 A 81109D 30 mL

 

转化液 B 81109E 30 mL

 

使用手册 81109sc 1 份

 

酵母化学感受态细胞制备试剂盒自备试剂 YPD 培养基

 

运输及保存 常温运输和保存，有效期一年。

 

使用方法 一：酵母化学感受态细胞的制备

 

说明：按本方法制备 1 管酵母化学感受态细胞就需要 OD600 达到 0.6-1.0 的新鲜酵母培养液 10 mL，用户需根据所需酵母感受态细胞的数量决定培养细胞的体

 

积。如果超过 10  mL，则制备液的使用量需要按比例增加

 

1.挑取酵母受体菌的新鲜的单菌落（4℃放置不超过 3 周的也可以），接种到装在 50mL 离心管中的 10 mL 的自备的 YPD 培养基中。

 

2.30℃摇晃培养，摇床速度 250 rpm/分钟，直到 OD600 达到 0.6-1.0

 

（相当于 0.6-1×107 细胞/mL）。

 

3.室温 3000rpm 离心 5 min，弃上清得酵母细胞沉淀。

 

4.新鲜制备适量的酵母感受态制备工作液。对 10 mL 酵母需要 5.25 mL 的工作液，其配制方法是：将 4.75 mL 制备液 A、0.25 mL 制备液 B 和0.25 mL 制备液C 加入到一个无菌的离心管中后充分震荡混匀即可。酵母感受态制备工作液可放室温待用。

 

5.用 0.5 倍体积的新鲜配制的酵母感受态制备工作液洗涤酵母细胞沉淀一次（对 10 mL 酵母则需要 5 mL 酵母感受态制备工作液）。即混合后振荡 1 分钟，室温 3000rpm 离心 3 分钟，去上清得洗涤后的酵母细胞沉淀。

 

6.再用 0.02 倍体积的酵母感受态制备工作液充分重悬菌体（对 10 mL 酵母，则需要 0.2 mL 酵母感受态制备工作液）。

 

7.按每管 0.2 mL 分装到冷冻管中，放入保温冰盒中冷却半小时后再放入

 

-80℃冰箱待用。0.2 mL 的感受态细胞足够 1 次转化使用。注意：放入保温冰盒的目的是使温度缓慢下降，急冻将使转化效率降低，这点跟   大肠杆菌感受态制备过程不同。

 

酵母化学感受态细胞制备试剂盒二：化学转化酵母感受态细胞

 

1.将总体积不超过 20 uL 的 0.1-5 ug 质粒 DNA 加到刚从-80℃冰箱取出的、还处于凝固状态的 0.2 mL 酵母感受态细胞上。注意：同时做一个不加质粒 DNA 的阴性对照组。

 

2.室温充分振荡直到凝固的感受态细胞完全融化。注意：此步非常关键，   如果能在恒温振荡器上 37℃振荡 5 分钟，则效果更好。

 

3.加入 1.4mL 转化液 A，轻柔颠倒混匀一分钟。

 

4.30℃培养 1 小时。

 

5.室温 3000g 离心 5 分钟，弃上清。

 

6.在酵母细胞沉淀中加 1.0 mL 转化液 B，振荡一分钟。

 

7.室温 3000g 离心 5 分钟，弃上清。

 

8.在酵母沉淀细胞中加入适量（如 100 uL）的转化液 B，混匀后在在选择培养基上全部涂盘。

 

9. 30℃培养 3-5 天后即得酵母转化菌落。

 

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